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立枯丝核菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)图片
产品货号:
BTN14-4260
中文名称:
立枯丝核菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)
英文名称:
Rhizoctonia solani SYBR qPCR Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本公司开发立枯丝核菌染料法荧光定量PCR试剂盒。


立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是一类重要的土传病原真菌。该病菌可侵染大量具有重要价值的植物如大豆、紫花苜蓿、小麦、棉花和甜菜等引起根腐病,严重影响植株的生长发育和产量。由于立枯丝核菌能在土壤中长期存活,且种群结构和致病性复杂,导致其引起植物根腐病的防治尤为困难。


  1. 即开即用,用户只需要提供DNA模板。
  2. 引物根据立枯丝核菌专一区设计,特异性高。
  3. 荧光定量PCR检测,比常规PCR更加灵敏。
  4. 一管式闭管操作,降低了交叉污染。
  5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
  6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。



组分规格
2×qPCR MagicMix500μL
荧光PCR专用模板稀释液1mL
立枯丝核菌染料法qPCR引物混合液100μL
立枯丝核菌染料法qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)50μL

保存:-20℃,有效期一年。


一、稀释PCR阳性对照(以102~107拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
注意:由于阳性对照浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
  1. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
  2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头,下同)。
  3. 在7号管中加入5μL 1×108拷贝/μL的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  4. 换枪头,在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  5. 换枪头,在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。


二、样品DNA的制备
  1. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL PCR阳性对照的10000倍稀释的(稀释后浓度为1×104拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝,可以将10μL原液加入到990μL自备TE溶液中,充分混匀,此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL自备TE溶液中,充分混匀,此为10000倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品DNA。
  2. 用自选方法纯化N+2个样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。


三、设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
  1. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液,浓度为14810拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。
  2. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
    成分样品管
    N+2个
    PCR阴性
    对照管
    PCR阳性对照管
    (2~7管)
    2×qPCR MagicMix10μL10μL各10μL
    立枯丝核菌染料法qPCR引物混合液2μL2μL各2μL
    自备10×ROX(见注)2μL2μL各2μL
    N+2待测样品cDNA模板6μL--
    自备超纯水-6μL-
    第7步所得PCR阳性对照稀释液(2~7号)--各6μL
    注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照,其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX,则用水替代。
  3. 盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
    过程温度时间
    预变性95℃5min
    PCR反应
    (40个循环)
    95℃15sec
    60℃1min,(采集SYBR通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行熔解曲线分析


四、数据处理
  1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品cDNA浓度的log值,再推算出其浓度。
  2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35~40之间,则重复一次。若重复结果Ct值小于40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。




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